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國產PCR儀ETC811與ETC811Plus主要性能測試

赫 曉 霞²  李 靜 雯²  陳 爾 凝²  鄒 明 強1  康 福 英²  張   捷3   羅艷非4  杜美紅²*

(1. 中國檢驗檢疫科學研究院，北京100123;2.北京市科學技術研究院分析測試研究所(北京市理化分析測試中心),北京 100094;3.中國海關科學技術研究中心，北京 100026;4.長春海關技術中心，吉林130031)

摘  要  為了解國產PCR儀ETC811與ETC811Plus主要性能，通過與同類國外儀器ABI9700和Eppendorf GSX1進行分組對標測試。使用紅外線精密測溫儀進行升溫速率、降溫速率、模塊控溫精度、溫度準確度、模塊溫度均勻性、溫度持續(xù)準確度的測試與分析，使用5000copy/PCR、500copy/PCR、50copy/PCR 溫度敏感序列擴增實驗進行生化性能  測試。結果顯示，使用2年以上組ABI9700與ETC811、使用2年以下組 ETC811Plus與Eppendorf GSX1平均升溫速率分別為2.40℃/s與2.30℃/s、2.50℃/s與2.60℃/s,平均降溫速率分別為2.20℃/s與2.10℃/s、2.00℃/s與2.10℃/s,  模塊控溫精度分別為0.020℃與0.045℃、0.025℃與0.030℃,溫度準確度的平均差值分別為-0.10℃與0.02℃、 0.17℃與0.11℃,模塊溫度均勻性的平均溫度差值分別為0.53℃與0.48℃、0.46℃與0.31℃,溫度持續(xù)準確度的相對偏差分別為相對偏差分別為5.3%與-0.8%、 -0.07%與-0.10%,生化性能擴增結果除使用2年以上組中ABI9700 為不可接受外，其他均為可接受。本研究測試的國產與進口PCR儀器各項溫控指標均優(yōu)于相關標準要求，且我國自主研發(fā)的ETC811與ETC811Plus具備與進口儀器等同甚至更優(yōu)的性能。

關鍵詞  國產儀器；PCR儀ETC811與ETC811Plus; 性能測試

聚合酶鏈反應 (Polymerase  chain  reaction,PCR)   是一種對特定 DNA 或 RNA 片段在體外進行快速、靈敏、特異擴增的方法[1]，溫度和時間對于PCR 擴增效率至關重要。因此，基于 PCR 技術原理完成特異擴增的 PCR 儀器的溫度控制性能是其核心功能。PCR 儀是生命科學研究中一種應用廣泛、十分重要的關鍵儀器，主要應用于需要基因擴增和制造突變的各個領域中[2]。自從美國ABI公司率先開發(fā)第一臺自動 PCR 儀以來，經過幾十年的發(fā)展，國內外 PCR 儀技術日趨成熟，但由于昂貴的進口 PCR 儀起步早， 一直處于領先地位，導致國產PCR儀在我國基礎科研中的普及率較低。

伴隨我國科技水平的提升，國產高精密分析儀器與進口產品之間的差距越來越小[3,4]。目前來自國內十多家生產商的20多種國產普通PCR 儀器已取得醫(yī)療器械注冊證[5]。國產自主研發(fā)的 ETC811 與 ETC811Plus PCR 儀器 ，ETC811 已獲得歐盟 CE 認證與醫(yī)療器械注冊證，ETC811Plus 已獲得我國藥監(jiān)局二類醫(yī)療器械注冊資質，國內用戶數量5000多個， 具有獨特且效果更優(yōu)的溫度均一性、防潮性能、靜電導流、低噪音、故障自檢和人性化操作界面等方面的 國家專利裝置。因此，本研究選用與其同類進口儀器 ABI9700 和 EppendorfGSX1 進行對標，其中ETC811 與 ABI9700 為使用2年以上組， ETC811Plus 與 EppendorfGSX1 為使用2年以下組，依據 YY/T 1173- 2010 《聚合酶鏈反應分析儀》[1] 方法進行儀器溫度控制性能測試實驗，依據 SN/T 2102.2-2008/ISO/TS 20836:2005《食源性病原體 PCR 檢測技術規(guī)范第 2 部分：PCR 儀性能試驗要求》[6] 方法進行儀器生化檢測性能測試實驗，通過測試評價國產PCR 儀 ETC811 與 ETC811Plus 的溫控性能與進口儀器之間的差異，以期為市場選用該類國產儀器提供理論依據。

1 方法

1.1 儀器設備

紅外線精密測溫儀(德國歐普士)。

1.2 試劑

TaKaRa MiniBEST  DNA  Fragment  Purification Kit，批號AJG1107A，  有效期2022.1。

1.3 溫度控制性能測試

1.3.1 升溫速率

分別在4臺測試儀器中編輯一個在45℃恒溫2min和95℃恒溫2min之間循環(huán)的程序，將紅外線溫度傳感器一端放入模塊四角、四邊中點和中心點測試孔，另一端連接數據采集儀，用數據采集儀記錄儀器到達設定溫度恒溫10s后至恒溫結束時間段內的溫度變化。取50℃±0.5℃內一溫度點TA，取90℃±0.5℃內一溫度點TB，計算從TA到 TB的時間t的平均升溫速率 V=(TB-TA)/t；掃描溫度從50℃±0.5℃升至90℃±0.5℃過程中的瞬時最大溫度變化△Tmax，計算最大升溫速率V升max=△Tmax/△t(△t和△Tmax由測溫儀給出 ) 。

1.3.2 降溫速率

在上述測溫數據中，取90℃±0.5℃內一溫度點TA，取50℃±0.5℃內一溫度點TB，計算從 TA 到 TB 的時間t的平均降溫速率 V=(TB-TA)/t；掃描此過程中的瞬時最大溫度變化△Tmax，計算最大降溫速率V降max=△Tmax/△t(△t和△Tmax由測溫儀給出)。

1.3.3 模塊控溫精度

在55℃±5℃、72℃±5℃、95℃±5℃各取一溫度點，設置恒溫2min,  循環(huán)次數為5的程序。將溫度傳感器一端放入模塊四角、四邊中點和中心點測試孔，另一端連接數據采集儀，用數據采集儀記錄儀器到達設定溫度恒溫10s后，計時30s, 記錄最高溫度和最低溫度，二者差值一半為△Ti(i=1,2,3,4,5),連續(xù)記錄5個循環(huán)。使用 SPSS19.0 軟件對△Ti值進行統(tǒng)計學差異分析。

1.3.4 溫度準確度

在55℃±5℃、72℃±5℃、95℃±5℃各取一溫度點，設置恒溫2min 的程序。將溫度傳感器一端放入模塊四角、四邊中點和中心點測試孔，另一端連接數據采集儀，用數據采集儀記錄儀器到達設定溫度恒 溫10s 后，計時60s, 每10s記錄溫度Ti(i=1,2,3,4,5,6)，取Ti平均值Tm, 計算Tm均值與設定溫度差值△T。 使用SPSS19.0 軟件對Ti 值進行統(tǒng)計學差異分析。

1.3.5 模塊溫度均勻性

在55℃±5℃、72℃±5℃、95℃±5℃各取一溫度點，設置恒溫2min,  循環(huán)次數為5的程序。將溫度傳感器一端放入模塊四角、四邊中點和中心點測試孔，另一端連接數據采集儀，用數據采集儀記錄儀器到達設定溫度恒溫10s后，計時60s, 記錄溫度Ti(i =1,2,3,4,5,6),取 Ti最大值與最小值，計算各孔位溫度差值△T。使用 SPSS19.0 軟件對 Ti 值進行統(tǒng)計學差異分析。

1.3.6 溫度持續(xù)準確度

編輯一個在45℃恒溫60s和95℃恒溫60s之間循環(huán)的程序，將溫度傳感器一端放入模塊測試孔另一端連接數據采集儀，以95℃±0.5℃為計時參考點，自顯示溫度首次到達計時參考點開始計時，至末次到達計時參考點結束，記錄時間Ti(i=1,2,3,4,5), 連 續(xù)記錄5個循環(huán)，取5個循環(huán)記錄時間的平均值Tm, 計算相對偏差 (Tm-60)/60*100%。使用SPSS19.0 軟件對Ti 值進行統(tǒng)計學差異分析。

1.4 生化檢測性能測試

在 AB19700 、ETC811 、ETC811Plus 、Eppendorf GSX1上對362bp 溫度敏感序列模板進行擴增并純化后，用Qubit 法測定DNA 目的片段濃度，計算并制備5000copy/PCR、500copy/PCR、50copy/PCR 的序列模板，各濃度模板擴增做5個反應體系(分別命名 為 a1-a5,b1-b5,c1-c5)，分別置于儀器反應板的四角與中心位置，在ABI9700、ETC811、ETC811Plus、EppendorfGSX1 四臺儀器同時進行擴增。

2 結果

2.1 升溫速率

使用2年以上組ABI9700 與 ETC811、使用2年以下組ETC811Plus與 EppendorfGSX1平均升溫速率 分別為2.40℃/s 與2.30℃/s 、2.50℃/s 與2.60℃/s,V升max分別為3.60℃/s 與3.40℃/s 、3.60℃/s與3.60℃/s。 即：使用2年以上組國產儀器 ETC811 的升溫速率略低，而使用2年以下組國產 ETC811Plus 與進口儀器 完全一致。

2.2 降溫速率

使用2年以上組ABI9700與ETC811、使用2年以下組ETC811Plus與 Eppendorf GSX1平均降溫速率分別為2.20℃/s 與2.10℃/s、2.00℃/s 與2.10℃/s,V降max分別為3.10℃/s與2.70℃/s、2.50℃/s 與2.60℃/s。 即：使用2年以上組國產儀器 ETC811 的降溫速率略低，而使用2年以下組國產 ETC811Plus 與進口儀器一致。

2.3 模塊控溫精度

使用2年以上組ABI9700與ETC811、使用2年以下組ETC811Plus與 Eppendorf GSX1最大△Ti分別為0.020℃與0.045℃、0.025℃與0.030℃,均< 0.05℃。即：使用2年以上組國產儀器 ETC811的模塊控溫精度顯著低于進口儀器 (P=0.001)，而使用2年以下組國產儀器 ETC811Plus與進口儀器的△Ti值無差異 (P=0.43)。

2.4 溫度準確度

使用2年以上組ABI9700與ETC811 、使用2年以下組 ETC811Plus 與 Eppendorf GSX1均值Tm與設定溫度差值分別為-0.03℃與-0.11℃、0.01℃與 0.12℃;在72℃±5℃的均值Tm與設定溫度差值分別為0.015℃與0.08℃、0.21℃與0.18℃;在95℃±5℃的均值Tm與設定溫度差值分別為-0.29℃與0.08℃、0.29℃與0.04℃,Tm與設定溫度差值的平均值分別為-0.10℃與0.02℃、0.17℃與0.11℃,絕對值均<0.3℃。 即：使用2年以上組國產儀器 ETC811的溫度準確度顯著優(yōu)于進口儀器 (P=0.013)，而使用2年以下組國產儀器ETC811Plus 與進口儀器間無差異 (P=0.884)。

2.5 模塊溫度均勻性

使用2年以上組ABI9700 與 ETC811、 使用2年以下組ETC811Plus 與 Eppendorf GSX1在55℃±5℃ 的各孔位溫度差值△T分別為0.48℃與0.39℃、0.44℃ 與0.24℃,在72℃±5℃的各孔位溫度差值△T 分別為0.57℃與0.52℃、0.42℃與0.30℃,在95℃±5℃ 的各孔位溫度差值△T分別為0.55℃與0.53℃、0.52℃ 與0.38℃,△T 均值分別為0.53℃與0.48℃、0.46℃ 與0.31℃,均≤0.55℃。即：使用2年以上組國產儀器 ETC811的模塊溫度均勻性顯著低于進口儀器  (P=0.000),而使用2年以下組國產儀器 ETC811Plus 與進口儀器間無差異 (P=0.881)。

2.6 溫度持續(xù)準確度

使用2年以上組ABI9700 與 ETC811、使用2年 以下組 ETC811Plus 與 Eppendorf GSX1 在60.00℃連 續(xù)記錄5個循環(huán)時間平均值Tm溫度分別為63.20℃與 59.50℃、59.96℃與59.94℃,相對偏差分別為5.3% 與-0.8%、 -0.07%與-0.10%。即：使用2 年以上組國產儀器ETC811的溫度持續(xù)準確度顯著優(yōu)于進口儀器 (P=0.000),而使用2年以下組國產儀器 ETC811Plus 與進口儀器間無差異 (P=0.905)。

2.7 生化性能

使用2年以上組ABI9700與ETC811、使用2年以下組ETC811Plus與 Eppendorf GSX1均成功擴增出 362bp 目的片段產物；對5000copy/PCR、500copy/ PCR、50copy/PCR  溫度敏感序列模板的擴增結果顯 示，使用2 年以上組國產儀器ETC811未擴增出 50copy/PCR,  結果為可接受，而進口儀器僅能擴增出 5000copy/PCR 模板，結果為不可接受；而使用2年以下組國產儀器ETC811Plus與進口儀器均可成功擴增出，結果均為可接受。即：使用2年以上組國產儀器 ETC811的生化性能優(yōu)于進口儀器，使用2年以下組國產儀器 ETC811Plus與進口儀器性能一致。

3 結 論

PCR 儀作為一項關鍵和常規(guī)的分子生物學技術設備，被廣泛應用于微生物、食品、醫(yī)學及動植物等領域中，是十分重要的生命科學儀器。溫控性能作為PCR 儀主要分析性能，其穩(wěn)定性、準確性及均勻性都會直接影響PCR設備測試結果。國產PCR儀ETC811系列在溫度均一性上具有自主研發(fā)的“環(huán)形非均勻輔助加熱系統(tǒng)”國家專利，其溫控性能是能夠與國外知名品牌相媲美的少數國產品牌。因此，本研究依據行業(yè)標準 YY/T1173-2010 與 SN/T 2102.2-2008/ISO/TS 20836:2005 設置并完成了國產PCR儀器ETC811與 ETC811Plus的升降溫速率、模塊控溫精度、溫度準確度、模塊溫度均勻性、溫度持續(xù)準確度以及最終通過溫度敏感序列擴增的生化性能等多個核心性能指標測試，通過同類進口儀器 AB19700與 Eppendorf GSX1的分組對標測試，并使用2年以上組與使用2年以下組的分組比較，對國產PCR儀器ETC811與ETC811Plus的核心性能進行了系統(tǒng)測試。結果顯示， 國產與進口儀器的各項溫控指標均優(yōu)于相關標準要求，且當下我國自主研發(fā)的PCR儀器ETC811與ETC811Plus已具備與進口儀器等同甚至更優(yōu)的性能。

表1 測試實驗結果匯總