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東勝龍 ETC811Plus PCR儀性能不輸進口儀器！替代國外儀器的絕佳選擇！
時間：2024-04-19 來源：EASTWIN瀏覽次數(shù)：71
兩種常用 PCR 儀的性能驗證與評價
聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction,PCR）是一種在體外放大擴增特定 DNA 片段的分子生物學技術。PCR 技術主要由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成。經(jīng)過多個循環(huán),目的片段能夠迅速、大量擴增。由于 PCR 技術具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點,所以近些年利用 PCR 技術對食源性微生物進行快速檢測的方法發(fā)展的十分迅速[1]。
近年來 PCR 儀品牌不斷增加,各種 PCR 儀溫度調(diào)控的準確性也得到了廣泛的關注。不同廠家生產(chǎn)的儀器,熱溫度特性也不盡相同。即便是同一臺儀器,由于其使用年限不同,其升降溫速率、溫度準確性和溫度一致性等相關性能也會發(fā)生變化,這些細微的偏差就很可能導致擴增結(jié)果出現(xiàn)假陰性或假陽性。在做PCR 檢測時,內(nèi)外界許多因素都會對擴增結(jié)果產(chǎn)生影響,但在這些影響因素中 PCR 儀的溫度特性起著至關重要的作用[2-4]。因此,運用 PCR 技術對食源性致病菌進行快速檢測的過程中,對儀器運行溫度的準確性和均一性要求很高,運行溫度上的細微差別可能會導致兩種不同結(jié)果的出現(xiàn)。
目前市面上對 PCR 儀的狀態(tài)和性能進行評估僅依靠 PCR 儀鑒定來完成,其弊端是傳感器無法準確反映 PCR 儀實際工作情況而且檢定數(shù)據(jù)采樣時間長。為此,利用已知含量的 DNA 模板對 PCR 儀的日常性能確定與評價就顯得十分必要[5]。
國產(chǎn)儀器在工藝與性能方面不斷進步、不斷提高,與進口 PCR 儀相比不僅價格低,在操作界面也更符合中國人的操作習慣。《檢測和校準實驗室認可準則》 CNAS-CL01: 2006 (等同于 ISO/ IEC17025:2005)也明確要求實驗室對設備進行期間核查[6]。為保證實驗關鍵設備的量值溯源性,實驗室會定期對實驗設備進行檢驗和校準,以確保測量結(jié)果的準確和可靠性,但是定期的檢驗和校準仍然無法保證設備的持續(xù)有效性及穩(wěn)定性,這是因為設備的機械性能、光學特性和電子性能等自身特性的原因,在整個 PCR 反應過程中出現(xiàn)的不穩(wěn)定現(xiàn)象。儀器的穩(wěn)定運行是保證結(jié)果穩(wěn)定可靠的重要基礎條件。因此,新儀器在使用前的驗證及評價尤為重要。
本文通過對 Eppendorf GSX1和 ETC 811 PLUS 退火溫度控制的準確度這一性能進行了比對與驗證,進而進行評估,了解結(jié)果差異性與一致性,以期尋找國產(chǎn)儀器可替代國外產(chǎn)品的可能性。
東勝龍 ETC 811 PLUS PCR 儀[蘇州東勝興業(yè)科學儀器有限公司]；Eppendorf GSX1 PCR 儀[德國Eppendorf 公司]；Heraeus Fresco 21 型冷凍離心機[美國 Thermo 公司]；Mili-Q 純水器[美國 Milipore 公司]；MB-202 金屬浴[杭州博日公司]；AlphaImager HP凝膠成像分析系統(tǒng)[美國 ProteinSimple]；PowerPacTMBasic 電泳儀[美國伯樂公司]等。儀器設備均在校準效期內(nèi)。
pSC17 質(zhì)粒,引物由上海捷瑞生物技術合成。TaKaRa PCR Amplification Kit 預混合液、TAE 電泳緩沖液等。
采用溫度敏感性序列 pSC17 質(zhì)粒為模板,稀釋為10 000個拷貝作為目的基因片段,分別使用Eppendorf GSX1 和 ETC 811 PLUS 進行 PCR 反應。M13 引物序列見（表 1）。
表 1 引物序列
取 PCR 產(chǎn)物 5μL 進行瓊脂糖凝膠電泳，染色觀察 PCR 產(chǎn)物片段大小。應用 Gel Extraction Kit 試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收并純化 362 bp 處的目的片段，將回收產(chǎn)物在核酸檢測板中上樣 2μL，應用酶標儀分析回收產(chǎn)物的濃度。
分別將回收產(chǎn)物稀釋為 10³、10²、10 copies/μL三個濃度,置于 PCR 儀內(nèi)運行熱循環(huán)程序,VAL 引物序列見表 2。96 孔板放置位置見圖 1,分別在兩個PCR 儀上進行反應。
表 2 引物序列
注：a、b、c、N 分別為 103 、102、10 copies/ μL 模板、N 為陰性對照
Eppendorf GSX1 和 ETC 811 PLUS 兩臺 PCR 儀以回收 PCR 產(chǎn)物為模板進行 PCR 擴增,1.2% 瓊脂糖凝膠電泳,并測定產(chǎn)物濃度?？梢钥闯鰞膳_ PCR 儀器均能在 362 bp 左右處產(chǎn)生特應性條帶（圖 2）。濃度測定結(jié)果分別為1.87*1010copy/μL 、1.94*1010copy/μL（表 2）,可以看出兩臺 PCR 儀所測濃度差異不大。
表 2 362bp 目的片段產(chǎn)物濃度測定結(jié)果
將 2.2.3 所述的稀釋、擴增后的樣本進行 PCR 擴增，1.2%瓊脂糖凝膠電泳，Eppendorf GSX1 PCR 儀A1-A5 孔、B1-B5 孔,即 103、102copies/μL 的模板均能在 116 bp 左右處產(chǎn)生特應性條帶。其中 C1-C5 孔，即 10 copies/μL 的模板條帶不明顯或無條帶，其中Eppendorf GSX1 PCR 儀 C2、C3、C4 處可見不明顯條帶、ETC 811 PLUS PCR 儀 C3、C4、C5 處可見不明顯條帶（圖 3、4）。
圖 3 PCR 產(chǎn)物純化后（Eppendorf GSX1）
參考 SN/T 2102.2-2008 的判定原則,當 5000、500copies/PCR 的樣品管中都可檢測到 PCR 產(chǎn)物,不論 50 copies/PCR 管中是否可檢測到產(chǎn)物,都是可接受結(jié)果[8]。兩臺 PCR 儀均未出現(xiàn)不可接受結(jié)果。
與分離培養(yǎng)法、形態(tài)觀察法、生化鑒定法、血清分型法等傳統(tǒng)的鑒定方法相比,核酸技術有著檢測周期短、靈敏度高等優(yōu)點,核酸技術不僅可以實現(xiàn)對致病菌的快速檢出,同時也能更好地認知微生物間、物種與功能基因間的相互作用機制,對防止食源性疾病的爆發(fā)和食源性致病菌的傳播具有重要意義[7]。
實驗室硬件條件會對核酸檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。因此,實驗儀器性能驗證是基因檢測實驗室欠缺和亟待提高的重要內(nèi)容。但目前精密檢測設備基本被國外壟斷,所以加快精密儀器的國有化進程,降低成本,推動民族品牌企業(yè)發(fā)展就顯得尤為重要。
本研究依據(jù)隨機取樣原理,參考了行業(yè)標準 SN/T2012.2《食源性病原體 PCR 靈敏度、重復性檢測技術規(guī)范第 2 部分：PCR 儀性能試驗要求》選取了特征孔,對 Eppendorf GSX1 和 ETC 811 PLUS 兩臺 PCR 儀性能進行整體評價[9]。Eppendorf GSX1 和 ETC 811PLUS 兩臺儀器均可達到檢測食源性病原體要求。在本次試驗中,且兩臺儀器均具有較好的重復性,且均未出現(xiàn)故障、穩(wěn)定性好、操作方便、檢測快速。符合實驗室質(zhì)量管理要求。本研究驗證結(jié)果與廠家描述一致,可用于食源性病原體檢測。
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[2] 程遠霞,魏燕,魯祥友,等.PCR 溫度特性實驗研究與分析[J].生命科學儀器,2008,(06)：52-56
[3] 馮玉輝,尹遵義,梁興忠,等.PCR 儀校準裝置探討[J].計量科學與技術,2021,65(08)：33-35
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[6] CNAS-CL01：2018《檢測和校準實驗室認可準則》[S].2018.6：52-56.
[7] 高雯暄,甘芝霖,陳愛亮,等.核酸技術在食源性致病菌檢測中的研究進展[J].食品安全質(zhì)量檢測學報,2017,11(24)：9440-9450.
[8] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準 SN/T 2012《食源性病原體 PCR 檢測技術規(guī)范第 2 部分：PCR 儀性能試驗要求》[S].2012.
[9] 饒紅,韓玥,郭錚,等.轉(zhuǎn)基因檢測實驗室實時熒光 PCR 儀期間核查方法的研究[J].現(xiàn)代測量與實驗室管理.2015,23(01)：45-47
