English
簡體中文
PCR實驗污染的強勢解決方案！實用貼！??！
時間：2018-05-02 來源：EASTWIN瀏覽次數(shù)：189
（一） 查找污染源
如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。
1、設(shè)立陰陽性對照：有利于監(jiān)測反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應(yīng)選擇擴增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強陽性對照可產(chǎn)生大量不必要的擴增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對照，100 個拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為PCR 敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點雜交等）檢測陰性的標(biāo)本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應(yīng)包括PCR 體系中各試劑的時機對照，即包括PCR 反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板DNA，這對監(jiān)測試劑中PCR 產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴增結(jié)果中試劑對照為陽性結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設(shè)立不同的反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上處理。
（二） 環(huán)境污染
在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，如果預(yù)防措施比較嚴(yán)密，則考慮可能為環(huán)境污染。環(huán)境污染中常見的污染源主要有：
1. 模板提取時真空抽干裝置；
2. 凝膠電泳加樣器；
3. 電泳裝置；
4. 紫外分析儀；
5. 切膠用刀或手術(shù)刀片；
6. 離心機；
7. 冰箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒炁_面等；
此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源：
1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；
2）0.1ml 去離子水浸泡；
3）取5ml 做PCR 實驗；
4）電泳檢測結(jié)果。
8. 氣溶膠。如果經(jīng)過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR 產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時就應(yīng)該更換實驗場所，若條件不允許，則重新設(shè)計新的引物（與原引物無相關(guān)性）。
（三） 污染處理
環(huán)境污染
1. 稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L 鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA 脫嘌呤； 2. 紫外照射（UV）法：紫外波長（nm）一般選擇254/300nm，照射30min 即可。需要注意的是，選擇UV 作為消除殘留PCR 產(chǎn)物污染時，要考慮PCR 產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV 照射僅對500bp 以上長片段有效，對短片段效果不大。UV 照射時，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA 鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV 照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV 波長，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰核苷酸的序列。在受照射的長DNA 鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA 鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA 斷裂等）均可終止Taq DNA 聚合酶的延伸。這些位點的數(shù)量與二聚體位點相當(dāng)。如果這些位點（ 0.13/堿基）在DNA 分子上隨機分布，一個500bp片段的DNA 分子鏈上將有32 處損傷位點，那么，105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反，如果100bp 的片段，每條鏈上僅有6 處損傷，105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV 照射有一定的片段長度限制的原因
可采用下列方法之一處理：
1. DNase I 法：PCR 混合液（未加模板和Taq 聚合酶）加入0.5U DNase I，室溫反應(yīng)30min 后加熱滅活，然后加入模板和Taq 聚合酶進行正常PCR 擴增。該方法的優(yōu)點是不需要知道污染DNA 的序列；
2. 內(nèi)切酶法：選擇識別4 個堿基的內(nèi)切酶（如Msp I 和Taq I 等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進行PCR； 3. 紫外照射法：未加模板和Taq 聚合酶的PCR 混合液進行紫外照射，注意事項與方法同上述UV 照射法；
4. g 射線輻射法：1.5kGy 的輻射可完全破壞0.1ng 基因組DNA，2.0 kGy 可破壞104 拷貝的質(zhì)粒分子，4.0 kGy 仍不影響PCR，但高于此限度會使PCR 擴增效率下降。引物可受照射而不影響PCR，g 射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來破壞DNA 的。
由于UV 照射的去污染作用對500bp 以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR 擴增片段通常為300bp 左右，因此UNG 的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。
1. 原理：在PCR 產(chǎn)物或引物中用dU 代替dT。這種dU 化的PCR 產(chǎn)物與UNG 一起孵育，因UDG 可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG 對不含dU 的模板無任何影響。UNG 可從單或雙鏈DNA 中消除尿嘧啶，而對RNA 中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。
2. dUTP 法：用dUTP 代替dTTP，使產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進行PCR 擴增前，用UNG 處理PCR 混合液即可消除PCR 產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG 在PCR 循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU 的新的PCR 產(chǎn)物。
3. dU 引物法：合成引物時以dU 代dT，這樣PCR 產(chǎn)物中僅5ˊ端帶dU。UNG 處理后，引物失去了結(jié)合位點而不能擴增。對長片段（1-2kb 以上）的擴增用dUTP 法效率較用dTTP低，而用dU 法就可克服這一缺點。dU 引物最好將dU 設(shè)計在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。
4. 優(yōu)點：可以去除任何來源的污染；UNG 處理可以和PCR 擴增在同一個反應(yīng)管內(nèi)進行；由于擴增產(chǎn)物中有大量dU 存在，可徹底消除污染源。
5. 需注意的是摻入dUTP 的DNA不應(yīng)對產(chǎn)物的任何操作有影響，在進行PCR 產(chǎn)物克隆時，應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-（UNG 缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會被受體菌UNG 消
化掉。
用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì)，原理如下：
1）用一生物素標(biāo)記的單鏈RNA 探針與待擴核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴增區(qū)；
2）用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸，通過漂洗可去除污染的擴增產(chǎn)物和雜質(zhì)；
3）洗脫靶分子后用特異引物擴增非RNA 探針雜交區(qū)域。第2）步的漂洗后可用PCR 檢測以確定標(biāo)本是否被擴增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。
也稱為鏈特異性PCR，主要指用于RNA 模板的特異性PCR 法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR 的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的3ˊ端（A 區(qū)）有2 0 個核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端2 0 個核苷酸（C 區(qū)）為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使cDNA 與多余引物分開，再用和第二引物（C）以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，以后的PCR 循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B 區(qū)和引物C 進行擴增加尾cDNA，而污染的DNA 或質(zhì)粒DNA 才不會被擴增。
該對引物擴增時通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中，在重組質(zhì)粒中，這一區(qū)域分成兩個區(qū)域與克隆位點被。如果重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本，也不能擴增出任何條帶，即使出現(xiàn)了擴增帶，其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA 才能被引物擴增，因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增帶就可以證明標(biāo)本是陽性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。
（聲明：內(nèi)容來自網(wǎng)絡(luò)，僅供分享之用，版權(quán)屬于原作者。如涉及版權(quán)問題，請與小編聯(lián)系。）
